CRISPR/Cas9基因编辑中的“超级剪刀”

DNA结构的发现使得人们初步认识基因结构,到PCR技术的出现实现基因的体外扩增,再到基于PCR技术的基因测序技术使人们第一次看到了人类基因组库的信息全貌。但是无论基因操作技术如何发展,都改变不了人们对基因编辑技术的狂热追求,因为他直接关系到人类疾病的诊断和治疗、优生优育以及人种的进化 基因编辑技术大致经历了3个发展阶段,以锌指核酸内切酶(ZFN类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN为代表的第一、二代技术以及以CRISPR/Cas9为代表的源于细菌一种获得性免疫系统的三代技术。CRISPR/Cas9技术相比前两代技术,具有成本低、制作简便、快捷高效的优点,让它迅速风靡于世界各地的实验室。近年来应用CRISPR/Cas9技术发表的高水平文章达到了10000余篇,该技术也是目前唯一被验证可应用于临床治疗的基因编辑技术,被誉为基因超级剪刀

云克隆一直致力于基因编辑技术的开发和研究,有CRISPR/Cas9技术平台及与之配套的慢病毒和腺病毒转染平台技术体系。CRISPR/Cas9基因编辑载体包含Cas9表达元件、sgRNA转录元件、筛选标记元件、原核复制元件等,导致转染质粒偏大,采用传统瞬时转染技术转染效率不高,而且效果不稳定,难以达到预期目的, 但慢病毒和腺病毒转染系统能很好的解决这个问题。慢病毒和腺病毒转染系统中的病毒株系均采用可感染哺乳动物细胞的病毒改造而来,从而使他们变成了一个很好的基因载体,通过筛选重组病毒并进行富集,便可直接用于侵染目的细胞。在重组病毒对目的细胞进行侵染的过程中,CRISPR/Cas9结构就会随着重组病毒基因组一并进入到目的细胞中(如图1所示)。通过这个侵染过程,一方面保证了目的片段对目标细胞的转染效率,另一方面借助病毒的表达原件实现了Cas9sgRNA的高效表达和转录,以保证对目的细胞基因组特定位点的高效剪切(如图2所示)。

我们采用慢病毒转染和CRISPR/Cas9技术相结合,对MCF-7细胞BECN1基因进行定点编辑。首先我们选择人BECN1基因的两个外显子区域中三个23碱基构成的CRISPR/Cas9靶序列(N20NGG(如图3所示),通过化学合成方法得到20ntguide序列及其互补序列sgRNA及其互补序列退火形成双链,借助BsmBI单酶切和酶连构建含有sgRNA序列信息的LentiCRISPRv2重组载体(如图4所示),LentiCRISPRv2中含有CRISPR/Cas9全部组件以及慢病毒的核心组件;接着LentiCRISPRv2重组载体和慢病毒的包装质粒共同转染293T细胞,在已共同转染293T细胞内慢病毒自我包装形成具有感染性的病毒颗粒,这些病毒颗粒基因组中也会包含CRISPR/Cas9的全部组件。收集病毒颗粒直接侵染MCF-7细胞株,重组病毒基因组会插入MCF-7细胞基因组中,通过嘌呤霉素筛选,最终获取稳定转染MCF-7细胞株。在稳定转染MCF-7细胞株内,Cas9sgRNA能够被稳定表达和转录,进而结合成剪切复合体,复合体被转运进入细胞核,以完成对sgRNA互补DNA片段的剪切,到达对目的片段定向剪切目的(如图5所示)。

   

对于基因敲除效果在蛋白水平的表现,我们通过WB做了进一步的验证,直接选取筛选过的细胞作为验证对象,通过WB技术半定量检测了BECN1蛋白的含量。检测结果如图6所示,选取的三个sgRNA都对MCF-7细胞的BECN1基因产生的重新的编辑,通过人为创造的移码突变使得BECN1蛋白的含量出现了显著性的下调。

CRISPR/Cas9技术目前被广泛的应用于基因敲除或基因敲入细胞系和动物的制备,以研究基因功能、疾病治疗、物种改造等多个领域,具有非常广泛的实践使用价值。云克隆一直致力于CRISPR/Cas9技术在细胞系和动物方面的应用,在技术方面进行了改进,能够更高效、快速的获取基因敲除或基因敲入细胞系和动物模型

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