云克隆教你出完美Western Blot条带
在Western Blot（WB）的实验过程中，总会遇到各种各样的问题：没有条带，杂带多，转膜不成功，曝光时间把握不好……WB实验周期长，操作步骤繁琐。怎么在繁琐的操作中快速找到问题所在是很多科研人员头疼的问题。不要急，云克隆用多年积攒的WB实验经验，为你分析解决WB实验过程中出现的各种状况。
一、SDS-PAGE出现异常条带
1. 微笑现象
可能原因：凝胶的中间部分凝固不均导致。
解决办法：待其充分凝固后再做实验。
2. 拖尾现象
可能原因：样品融解效果不佳；电泳缓冲液时间过长；分离胶浓度过大引起。
解决办法：加样前离心；加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
3. 条带粗
可能原因：蛋白在浓缩胶中未浓缩好。
解决办法：增加浓缩胶长度；保证浓缩胶的pH正确；降低电压。
4. 纹理现象
可能原因：样本中有不溶性颗粒。
解决办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。
二、如何选择转膜条件及膜
下图为不同转膜方法的转膜效率对比，展示转膜后胶上剩余条带：
结论：
转膜效率：湿转过夜>湿转3小时>半干转1小时
NC膜和PVDF膜对比：
NC膜 | PVDF膜 | |
物理强度 | 差 | 好 |
溶剂耐受力 | 无 | 有 |
SDS存在下蛋白质结合力 | 差 | 好 |
因此，针对转膜我们有以下建议：
1. 在转膜过程中，靶蛋白分子量小转膜时间适当缩短，分子量大则适当延长转膜时间；
2. 优先选择聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，其相对硝酸纤维素（NC）膜机械强度高，和蛋白结合牢。
三、WB案例分析
1. 条带出现降解或断裂带
lane 13：心脏组织震动溶解2h；
lane 14：心脏组织短时超声1~3min；
lane 15：心脏组织超声10min.
处理方法：样本制备过程中尽量保持低温，避免蛋白变性、降解、断裂，对于胃肠胰等蛋白酶含量高的样本建议添加蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂建议新鲜配制。
2. 曝光时间过长或过短出现非特异性带或条带消失
处理方法：建议选不同时间点多曝光几次。
3. 条带不整齐
原因分析和处理方法：
1）可能是由于胶凝固不均匀，建议待胶完全凝固后上样；
2）可能是由于电泳的时，有气泡在胶的下边缘，建议电泳前，检查并赶走胶底部的气泡；
3）可能是由于上样buffer不是工作液浓度，建议重新配置上样buffer；
4）可能是由于拔梳子导致样品孔不齐，建议水平缓慢的拔梳子。
4. 无条带
原因分析和处理方法：
1）可能是转膜失败，可以通过丽春红染色检验；
2）可能是一抗二抗用错或浓度不合适，可设置阳性对照或重新调整抗体浓度；
3）ECL发光底物失效，可换用新的发光底物。
5. 杂带多
原因分析和处理方法：
1）非特异条带，可能是一抗特异性不好，也有可能是二抗，可以更换抗体试试；
2）蛋白有多个isoform，或者是前体、剪切、修饰；
3）样本制备过程中蛋白出现降解或者断裂带，重新制备样本。
WB的实验流程相对较长，每个步骤都会对最后的实验结果造成影响，在实验过程中应步步监测，做好质控，以便随时发现问题、找到问题。云克隆希望能为广大的科研人员在科研道路上少走弯路尽自己的一份微薄之力。