Multiplex Assay Kit标准曲线拟合和样本计算方法
云克隆基于国际最新流式荧光发光法（Flow Luminescence Immunoassay，FLIA）开发推出了Multiplex Assay Kit。FLIA技术使用流式细胞术分析不同荧光标记的微球，同时对多种不同的生物学指标进行检测。
Multiplex Assay Kit试剂盒的数据如何完成标曲拟合及样本计算呢？能否用EXCEL软件完成呢？接下来我们以 Cloud-Clone Corp.的 LMA079Hu 人白介素6(IL6)等多因子检测试剂盒（流式荧光发光法）及LMA461Ge 雌二醇(E2)等多因子检测试剂盒（流式荧光发光法）实验结果为例，展开详细介绍。
LMA079Hu 利用双抗夹心法定量测定样本中IL6含量。如图1所示，最高浓度的标准品（500pg/mL）经4倍倍比稀释至0.49pg/mL，空白孔为标准品稀释液（0浓度孔）。
图1. 标准曲线数据
首先将标准品各孔的MFI值减去空白MFI值（本底），得到校正MFI值，以标准品各孔的校正MFI值取Log10后的值为X轴（标黄色），标准品相应浓度取Log10后的值(标红色)为Y轴，作XY散点图，得到一条6点曲线，其中X轴为校正MFI的对数值（Log of MFI），Y轴为浓度的对数值（Log of Conc.），如图2所示。
图2. 标准曲线示例图
接下来我们看看如何做出图2中的标准曲线，选中Log of MFI及Log of Conc.各数据（标黄色及红色区域），左键点击插入，再左键点击XY散点图（见图3A）。图表上便会弹出散点图（见图3B），鼠标左键点击曲线中的任何一点，图中6点都会被选中，点击鼠标右键，在菜单栏中选择“添加趋势线”。在页面右边出现的菜单栏里左键点击“趋势线”，选择“多项式(P)”并将“顺序”设定为2。最后，勾选“显示公式(E)”和“显示R平方值(R)”（如图3C），便会出现标准曲线的对应公式及R2 值（如图2所示）。
图3A. 标曲拟合过程示意图A
图3B. 标曲拟合过程示意图B
图3C. 标曲拟合过程示意图C
图3. 标曲拟合过程示意图
得到公式后，将样本MFI值扣除空白MFI值，得到样本校正MFI值，将校正MFI值取对数后作为X带入公式，算得Y值后，做以10为底的指数运算，若样本原液检测，计算的Y值为样本中靶因子的浓度，若样本稀释后检测，计算的Y值乘以稀释倍数，为样本中靶因子的浓度。
对于一些化学小分子及多肽类物质，常采用竞争法测定，竞争法标曲拟合与双抗夹心法有所不同，详细标曲拟合和样本计算方法如下：
LMA461Ge利用竞争法定量测定样本中E2含量。如图4所示，最高浓度的标准品（1000pg/mL）经4倍倍比稀释至0.98pg/mL，空白孔为标准品稀释液（0浓度孔）。
图4. 标准曲线数据
将标准品各孔的MFI值取Log10后的值为X轴（标黄色），标准品相应浓度取Log10后的值(标红色)为Y轴作XY散点图，得到一条6点曲线，其中X轴为MFI的对数值（Log of MFI），Y轴为浓度的对数值（Log of Conc.），如图5所示。
图5. 标准曲线示例图
接着，选中Log of MFI及Log of Conc.各数据（标黄色及红色区域），左键点击插入，再左键点击XY散点图（见图6A）。图表上便会弹出散点图（见图6B），鼠标左键点击曲线中的任何一点，图中6点都会被选中，点击鼠标右键，在菜单栏中选择“添加趋势线”。在页面右边出现的菜单栏里左键点击“趋势线”，选择“多项式(P)”并将“顺序”设定为2。最后，勾选“显示公式(E)”和“显示R平方值(R)”（如图6C），便会出现标准曲线的对应公式及R2 值（如图5所示）。
图6A. 标曲拟合过程示意图A
图6B. 标曲拟合过程示意图B
图6C. 标曲拟合过程示意图C
图6. 标曲拟合过程示意图
得到公式后，将样本MFI值取对数后，作为X带入公式，算得Y值后，做以10为底的指数运算，若样本原液检测，计算的Y值为样本中靶因子的浓度，若样本稀释后检测，计算的Y值乘以稀释倍数，为样本中靶因子的浓度。
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